體外診斷試劑的原料可以分為兩大類

  一類是具有生物活性的可以特異性識別待測靶分子或催化其反應(yīng)的生物大分子原料。

  另外一類是不直接參與反應(yīng)的各類有機(jī)和無機(jī)的小分子物質(zhì)的非生物活性原料。

  體外診斷試劑原料是指用于生化、免疫或分子診斷等試劑的反應(yīng)體系原料，主要指反應(yīng)體系。按照性質(zhì)不同，體外診斷試劑原料可以分為：抗原和抗體、酶與輔酶以及其他原料。上游原料決定了體外診斷試劑檢測水平質(zhì)量的好壞，可以說這些關(guān)鍵原材料的選擇和研制，影響體外診斷試劑各項性能水平(如靈敏度、穩(wěn)定性)和應(yīng)用價值，篩選到合適的原材料是研發(fā)的首要環(huán)節(jié)。也是體外診斷試劑成本構(gòu)成主要的部分。

  那么生物活性原材料主要包括哪些呢?

  一是抗原：包括蛋白質(zhì)，多糖，多肽，脂，小分子化合物等，有天然抗原和人工抗原，從生物組織或細(xì)胞直接獲得的為天然抗原，通過基因工程，化學(xué)合成等方法制備的抗原為人工抗原。

  二是抗體，主要包括單克隆抗體和多克隆抗體。

  三是酶，在體外診斷試劑原料中統(tǒng)稱為工具酶。

  其他原料

  其他原料包括膠體金、酶底物系統(tǒng)、發(fā)光物質(zhì)等信號體系，NC膜、酶標(biāo)板、磁珠等反應(yīng)體系載體，以及各種生物活性材料和精細(xì)化學(xué)原料等，起到幫助呈色、提供載體場所或提升原料性能等作用，以保障診斷反應(yīng)穩(wěn)定且順利進(jìn)行。

  生物活性原料研發(fā)的基本原則

  抗原的研發(fā)無論是天然抗原還是重組抗原，抗原是制備抗原類體外診斷試劑的原料，包括原核/真核重組抗原、天然抗原等，通過基因工程重組技術(shù)、蛋白純化技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)以及化學(xué)合成技術(shù)等方法制備，適用于傳染病診斷、食品安全診斷、消化道疾病診斷以及免疫系統(tǒng)疾病診斷等。都是通過純化的方式獲得，針對重組抗原更重要的抗原分子的設(shè)計，表達(dá)載體和宿主的選擇。

  抗體的研發(fā)包括多克隆抗體和單克隆抗體，通過免疫技術(shù)、雜交瘤細(xì)胞技術(shù)、細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)等方法儲備，用于心血管疾病診斷、傳染病診斷等。多克隆抗體主要通過免疫原和免疫動物，以及免疫劑量，免疫程序進(jìn)行優(yōu)化，單克隆抗體相對復(fù)雜還需要后期的雜交技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞篩選，再次免疫來獲得識別特異性表位的抗體。當(dāng)然有很多抗體得到后可以進(jìn)行測序，通過基因重組的方式來大規(guī)模獲得。

  酶和輔酶是制備熒光定量PCR及基因診斷等分子診斷試劑、免疫診斷試劑及生化診斷試劑的原料，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、堿性磷酸酶等，主要適用于基因檢測、傳染病診斷、凝血診斷、肝腎功能生化診斷等多種檢測領(lǐng)域。酶的獲得也是主要通過純化的方式來進(jìn)行。因此蛋白純化技術(shù)和抗體制備技術(shù)作為兩項關(guān)鍵的主要技術(shù)是生物活性原料開發(fā)的關(guān)鍵。會涉及到生物化學(xué)，分子生物學(xué)，免疫學(xué)，微生物學(xué)，基因工程，蛋白質(zhì)工程，酶工程等多種學(xué)科。

  生物活性原料的規(guī)模化制備

  包括原材料準(zhǔn)備，預(yù)處理，初純和精純。

  原材料準(zhǔn)備可以直接選擇動植物的組織或細(xì)胞，或是通過基因工程手段得到的工程細(xì)胞和工程菌。

  原材料預(yù)處理，通常而言可以采用高速勻漿，液氮研磨或超聲等機(jī)械方式來破碎組織和細(xì)胞，也可以通過低滲，反復(fù)凍融，酶消化或表面活性劑處理等非機(jī)械方式，但要注意的是破碎的強(qiáng)度，太小釋放不充分，太大又會導(dǎo)致生物活性原料變性。破碎后的原料會呈現(xiàn)渾濁，可以通過高速離心，濾膜過濾等方式去除或者采用飽和硫酸銨沉淀后去除。

  初純階段主要通過沉淀和離心過濾的方法，常用的有硫酸銨沉淀法，優(yōu)球蛋白沉淀法，等電點(diǎn)沉淀法等非變性沉淀法，或者利用有機(jī)溶劑，酸堿，熱等變性沉淀法。

  精純主要依據(jù)分子大小，形狀，表面電荷分布，親疏水性以及特異性結(jié)合等性質(zhì)進(jìn)行的各種層析分離，主要包括離子交換層析，分子篩交換層析，親和層析，疏水層析以及電泳等技術(shù)進(jìn)行分離。

  生物活性原料的保存

  影響生物活性原料溶液狀態(tài)保持的因素包括pH、離子強(qiáng)度、污染或殘留的蛋白酶、保存的溫度和反復(fù)凍融的次數(shù)?？梢酝ㄟ^添加一系列的，緩沖體系，低溫保存，表面活性劑，蛋白酶抑制劑，防腐劑，還原劑等來維持原材料的穩(wěn)定。這里常用的技術(shù)就是凍干技術(shù)。

  生物活性原料的質(zhì)量控制

  質(zhì)量控制關(guān)鍵的是對每批純化后的原料進(jìn)行濃度，純度鑒定，通過Elisa，蛋白定量，SDS-PAGE等方法進(jìn)行，體外診斷試劑的生物活性原料應(yīng)該是高純度，高活性且狀態(tài)均一的成品，應(yīng)保證外觀，濃度，純度，均一性和生物活性。

  影響穩(wěn)定性的原因

  在體外診斷試劑所用的原料中，抗體、抗原、酶等蛋白質(zhì)是很重要的關(guān)鍵原料。其所具有的特異性結(jié)合、催化反應(yīng)功能，對在預(yù)處理、貯存、使用加工等操作過程中存在的潛在有害影響非常敏感。保存在密封、干燥的環(huán)境將有助于確保長時間的穩(wěn)定，但除非蛋白得到適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)，否則干燥過程有也可能使蛋白發(fā)生嚴(yán)重的變性。而保存在溶液狀態(tài)，潛在的危害因素將會增多。比如很簡單的一個方面，pH值或者緩沖溶液的改變就能夠使蛋白在溶液中的穩(wěn)定性明顯不同。使某種溶液狀態(tài)穩(wěn)定的方法并不一定就對另一種溶液有效。在生產(chǎn)過程中的其他因素也有可能影響產(chǎn)品的性能。這些因素包括原料來源、稀釋和定時錯誤、溫濕度不合適、曝光和容器材料等。為了保證診斷檢測的有效期和精確性，這些原料蛋白必須保持穩(wěn)定和有效。因此，在診斷試劑中必須要添加適當(dāng)?shù)模m量的蛋白保護(hù)劑。

  干燥狀態(tài)穩(wěn)定性

  盡管大多數(shù)蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)的自然構(gòu)象下發(fā)揮作用，但干燥或者冷凍狀態(tài)仍然是穩(wěn)定保存的首要選擇。在這些相對穩(wěn)定的狀態(tài)下，諸如蛋白酶、氧化劑等有負(fù)作用的溶劑與蛋白質(zhì)的頻繁碰撞將會得到很大限度的減少。但是通過干燥或者其他相變方式，比如沉淀和冷凍，將溶劑從蛋白分子中去除，將可能損害蛋白質(zhì)的功能構(gòu)造。這些相變可能使通常折疊在分子內(nèi)部的疏水氨基酸暴露在分子表面，從而造成蛋白質(zhì)分子通過疏水表面與其他分子結(jié)合，導(dǎo)至蛋白質(zhì)分子的變性。干燥的方式包括自然風(fēng)干或者冷凍干燥，例如試劑瓶中結(jié)合物的干燥、塑料板或者膜材料上包被抗體的干燥。

  在要干燥的溶液中加入適當(dāng)?shù)娜苜|(zhì)來防止蛋白質(zhì)變性是一種非常有效的保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定的方法。這些溶質(zhì)的特點(diǎn)是都具有親水基團(tuán)，這些基團(tuán)通過掩蓋疏水性氨基酸從而達(dá)到穩(wěn)定蛋白質(zhì)功能構(gòu)造的作用。因此，由于在干燥時溶劑的去除會促進(jìn)蛋白與蛋白，尤其是蛋白與固相表面的相互作用，所以在干燥前加入保護(hù)劑非常重要。

  無論是干燥方法還是保存條件，想要保持穩(wěn)定都有很苛刻的要求。當(dāng)?shù)鞍讘?yīng)用到膜上時，通常要求非?？焖俚母稍锘蛘邇龈?，以保持蛋白性能和活力。而對于平板、試管或者微珠的蛋白包被來說，相對于快速干燥，確保組分的徹底干燥則更為重要。為了得到很大限度的有效期，所有干燥后的產(chǎn)品都需要保存在放有干燥劑的密閉容器中。

  溶液狀態(tài)穩(wěn)定性

  雖然抗體、抗原、酶以及其他診斷用蛋白在水溶液中處于天然的機(jī)能狀態(tài)，但這并不是它們穩(wěn)定的狀態(tài)。在溶液中，有眾多的因素影響著蛋白的活性功能：

  蛋白質(zhì)分子變得更加柔韌易折，從而傾向于改變構(gòu)象。

  蛋白質(zhì)分子和其他分子以及容器壁的碰撞頻率增加了。

  微生物污染的可能性增加了。

  對溫度升高和蛋白濃度降低造成的影響更加敏感。

  蛋白質(zhì)更易被氧化。

  通常來說，溶解的蛋白質(zhì)分子在較低的溫度和較高的蛋白濃度下穩(wěn)定。在剛好高于冰點(diǎn)的時候，蛋白質(zhì)分子擁有較少的動能，而這些動能是蛋白質(zhì)“擺脫”其能量低的功能構(gòu)造所必需的。在溶液中，部分蛋白活性的損失是由容器壁的吸附、寡聚酶的解聚以及氧化劑、水解酶、微生物等痕量污染物對蛋白質(zhì)的滅活等原因造成的，而在越高的蛋白濃度下(毫克每毫升范圍或更高)，損失的蛋白活性占蛋白總活性的比例也就越低。

  影響穩(wěn)定性的其他因素

  蛋白來源、純化方式以及化學(xué)偶聯(lián)的方法都能影響蛋白試劑的活性和穩(wěn)定性。例如，堿性磷酸酶的來源就對復(fù)合物的穩(wěn)定性有重大影響;就溶液的穩(wěn)定保存而言，將所需蛋白與對蛋白有傷害作用的酶(如水解酶、氧化酶)從原料中分離是非常重要的。若要保證溶液穩(wěn)定，就必須去除或者滅活這些有害酶以及能產(chǎn)生這些酶的微生物。在合成復(fù)合物時，大量的化學(xué)反應(yīng)步驟已被證明能使酶和抗體分子之間形成共價鍵。其中的一些方法對某些酶-抗體復(fù)合物的穩(wěn)定負(fù)面影響較低。如果一種酶聯(lián)復(fù)合物喪失了酶聯(lián)檢測的活性但仍保持有酶活力，那么另外選擇一種化學(xué)偶聯(lián)方法也許能解決這個穩(wěn)定性問題。

  有時候，被認(rèn)為是穩(wěn)定性方面的問題實際上是由其他變數(shù)造成的蛋白量不足。也許就是一個很明顯的稀釋錯誤。生產(chǎn)商必須棄用那些有可能吸收蛋白或者抑制蛋白活性的容器材料，例如未處理的聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯或者玻璃。聚乙烯和聚丙烯是比較可取的容器材料。有色酶和其他含有氧化金屬離子的蛋白溶液不能暴露在陽光下。

  蛋白保護(hù)劑種類

  影響蛋白活性的因素主要有溶液的PH值、鹽分和糖分的濃度、微生物的作用及空氣的氧化等。針對市場的需要，目前市面上有很多商品化的蛋白保護(hù)劑可供臨床和科研生產(chǎn)廠家大批量使用，主要用于微孔板的封閉穩(wěn)定、抗體稀釋液、蛋白稀釋液、酶穩(wěn)定液等。選擇這些商品化的試劑在研發(fā)初期會給部分企業(yè)解決很多問題并且節(jié)省研發(fā)時間。有些企業(yè)，出入成本的考慮，也會著手研發(fā)自己的蛋白保護(hù)液配方以降低成本以及獲得更好的效果。目前蛋白保護(hù)劑主要包括：多羥基化合物、糖、氨基酸、聚合物、蛋白質(zhì)等。

  原料，是診斷試劑的重點(diǎn)。在絕大多數(shù)項目的原料乃至優(yōu)良原料唾手可得、原料來源與國際大廠比肩的如今，中國的體外診斷工業(yè)可以將更多精力和智慧集中在改進(jìn)和優(yōu)化工藝上，精雕細(xì)琢，終能打造蜚聲國際的精品。